鄭鳳家1別明江2孫成均1*

1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，成都610041；

2.四川大學(xué)華西第四附屬醫(yī)院檢驗科，成都，610041

摘要：[目的]建立了人血清中維生素A和E的分散液相微萃取（dispersive liquid phase microextraction，DLPME）-高效液相色譜分析方法。[方法]取血清20μl，加入50μl甲醇，漩渦震蕩10s后加50μl三氯甲烷超聲萃取，高速離心后吸取下層三氯甲烷層供高效液相色譜分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。色譜分析條件為：色譜柱為Eclipse XDB – C8（150 mm × 4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（96+4）；流速為0.80 ml/min；柱溫為25℃；紫外檢測波長：維生素A為325nm，維生素E為292nm。[結(jié)果]維生素A和E標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%。對于20μl血清，本法的檢出限維生素A為0.035μg∕ml；維生素E為0.09μg∕ml。維生素A和E的加標(biāo)回收率分別為90.4%～103.2%和81.0%～92.1%。[結(jié)論]本法靈敏、準(zhǔn)確、快速、簡便，節(jié)約有機溶劑，適合于血清中維生素A和E的快速測定，是環(huán)境友好型的綠色分析方法。

關(guān)鍵詞：分散液相微萃取；維生素A；維生素E；高效液相色譜；血清

Simultaneous determination of vitamin A and E in microamount of human serum by dispersive liquid phase micro-extraction – high performance liquid chromatography

ZHENG Fengjia, BIE Mingjiang, SUN Chengjun*

West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China

Abstract:[Objective]To establish a dispersive liquid phase microextraction–high performance liquid chromatography for simultaneous?determination of vitamin A and E in microamout of human serum.[Method]Twenty microliter?of human?serum was taken and 50μl?methanol added to precipitate?the protein, and 50μl chloroform?added to extract vitamin A and E ultrasonically. After centrifuged at 12000rpm for 5 min, the lower chloroform layer was taken and injected for HPLC analysis. The optimized?chromatographic conditions were as follows: analytical column: (Eclipse XDB-C8,?150?mm?× 4.6?mm，5μm); mobile phase:?methanol-water (96+4); flow rate: 0.80 ml/min; column temperature: 25℃; detection wavelength: 325nm for vitamin A and 292nm for vitamin E, respectively.[Results]The correlation coefficients for the standard curves were greater than 0.999 for both vitamin A and E; the detection?limits?of the method were 0.035μg?∕?ml?for vitamin A and 0.09μg?∕?ml?for vitamin E. The recoveries of vitamin A and E in human serum ranged from?90.4%～103.2% and?81.0%～92.1%, respectively.[Conclusion]The method is sensitive,?accurate, rapid, simple,?and suitable for the determination?of vitamins A and E in microamount of human serum.

Key words :Dispersive liquid phase microextraction；Vitamin A；Vitamin E；Human Serum；High performance liquid chromatography

::__IHACKLOG_REMOTE_IMAGE_AUTODOWN_BLOCK__::0*通訊聯(lián)系人：孫成均，教授。E-mail：sunchj2005@yahoo.com.cn

維生素A 和維生素E是維持機體正常生長的必需脂溶性維生素。目前，國內(nèi)外測定血清［1］和全血［2］中維生素A和E的方法很多。這些方法中的前處理技術(shù)有液－液萃取［1］、固相萃取［3］、濁點萃取［4］等等。這些前處理技術(shù)有的繁瑣耗時、需要較多有機溶劑，且血清量需要量較大。整個樣品分析過程中，前處理過程所需的時間占整個分析時間的2/3，并可能產(chǎn)生1/3以上的誤差［5］。分散液相微萃取（dispersive liquid phase micoextraction, DLPME）技術(shù)首先見于Rezaee等[6-7]的報道，該法集萃取和濃縮于一體，是一種操作簡單、快速、成本低且對環(huán)境友好的樣品前處理新技術(shù)。現(xiàn)在分散液相微萃取技術(shù)對生物樣品和環(huán)境樣品中的農(nóng)藥［8-10］、重金屬［11-12］等的提取報道很多，但在血清中維生素A和E的測定中尚未見報道。

本文將該技術(shù)應(yīng)用于萃取濃縮微量人血清中的維生素A和E，大大縮短了分析時間，減少了樣品和有機溶劑的用量，降低了分析成本，為分析人微量血清中維生素A和E的含量提供了快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的方法，在人群血清維生素A和E的快速檢測中有很好的應(yīng)用價值。

1. ?實驗部分

1.1.儀器與試劑高效液相色譜儀（EX1600，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）,帶紫外檢測器（EX1600UV）；C8柱（Eclipse XDB-C8，4.6 mm × 15 cm，5.0μm），同類型保護(hù)柱；WH-1微型漩渦混合儀；臺式高速離心機（Anke TGL-16B）；超聲波清洗器(KQ-250型)。維生素A（視黃醇）標(biāo)準(zhǔn)品（FLUKA，>99％）；維生素E標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma，>95%）；三氯甲烷（色譜純）；甲醇（色譜純）；維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1mg/ml）：甲醇配制，于-20℃冰箱冷藏保存；維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲備液（2mg/ml）：甲醇配制，于-20℃冰箱冷藏保存；維生素A和E混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（VA 1μg/ml，VE 5μg/ml）：測定前，按文獻(xiàn)［13］方法對維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度進(jìn)行標(biāo)定，再以其實際濃度用甲醇稀釋成混合液。實驗用水為Millipore超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2實驗方法

1.2.1色譜條件流動相為甲醇-水（96+4），超聲波脫氣后使用；流速：0.8 ml/min；柱溫：25℃；波長切換程序：0～5.0min，325 nm，5.0～10min，292 nm。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在高效液相色譜儀基線達(dá)平直后，分別進(jìn)樣VA 和VE 混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液?2.00、5.00、10.0、20.0μl（相當(dāng)于VA ?2，?5，10，20ng，?VE ?10，25，50，100?ng），以保留時間定性，記錄各自峰面積。分別以VA和VE含量（ng）?對峰面積線性回歸。維生素A和E標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

圖1維生素A和E混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

Fig 1 The chromatogram of vitamins A and E standard solution

1.維生素A（Vitamin A，3.8min） ?2.維生素E（Vitamin E，8.4min）

1.2.3 樣品處理與測定取新鮮人血清20μl于200μl EP管中，加入50μl甲醇漩渦混勻10s，然后加入50μl三氯甲烷，超聲萃取3min后，以12000 r/min離心5min。用微量進(jìn)樣針伸入EP管底部取10μl萃取液進(jìn)樣分析，樣品圖譜見圖2。

1.2.4 結(jié)果計算 ???根據(jù)樣品圖譜維生素A和E的峰面積，通過回歸方程計算進(jìn)樣液中維生素A和E的含量（ng），按下式計算血清中維生素A和E的濃度（μg /ml）。

式中：::__IHACKLOG_REMOTE_IMAGE_AUTODOWN_BLOCK__::3為維生素A和E的濃度（μg／ml），::__IHACKLOG_REMOTE_IMAGE_AUTODOWN_BLOCK__::4為由回歸方程計算的進(jìn)樣液中維生素A或E的含量（ng）。

圖2樣品萃取后維生素A和E的色譜圖

Fig 2 The chromatogram of a human serum sample

1.維生素A（Vitamin?A，3.8min） ??2.維生素E（Vitamin E，8.4min）

2結(jié)果與討論

2.1液相微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 ?液相萃取劑的選擇 ??實驗選取了三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷3種有機溶劑進(jìn)行萃取條件試驗。試驗結(jié)果表明，在相同條件下，三氯甲烷的萃取效率及其穩(wěn)定性要高于二氯甲烷和正己烷，二氯甲烷盡管萃取效率高，但易揮發(fā)，結(jié)果不穩(wěn)定，故本法選三氯甲烷作為液相微萃取劑。

2.1.2 ?三氯甲烷萃取劑體積的選擇 ?實驗選擇了20μl、40μl、50μl在相同條件下萃取樣品，當(dāng)萃取劑體積為20和40μl時，萃取效率偏低，且不穩(wěn)定，當(dāng)萃取劑量達(dá)到50μl時，萃取效率達(dá)到分析要求，且實驗結(jié)果穩(wěn)定性好，因此選擇三氯甲烷萃取劑的體積為50μl。

2.1.3 ?超聲萃取時間的選擇分散液相微萃取是一個樣品的富集平衡過程，需要一定的時間。實驗研究了1min、3min、5min這三個時間點的超聲萃取效果，3min時效果最佳，而1min時萃取效率過低，這可能與超聲時間過短，尚未達(dá)到富集平衡有關(guān)。5min時實驗結(jié)果不穩(wěn)定，這可能和超聲時間過長，萃取劑揮發(fā)損失以及維生素A和E部分分解有關(guān)。所以，本法選擇超聲萃取時間為3min。

2.2 ?方法性能指標(biāo)

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線本法實驗條件下，維生素A和E的線性范圍遠(yuǎn)大于實驗范圍，考慮到本法主要用于微量血清中維生素A和E的測定，故未測定線性范圍上限。在本實驗線性范圍內(nèi)，維生素A的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=677.8m?+23.95，相關(guān)系數(shù)r=0.9991；維生素E的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=32.85m+70.5，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。為了檢驗分散液相微萃取過程對標(biāo)準(zhǔn)系列的影響，在樣品微萃取條件下對標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行處理后再測定，結(jié)果所得維生素A的工作曲線方程為：A = 605.31m?+18.85，相關(guān)系數(shù)r=0.9990；維生素E的工作曲線方程為：A?=?35.96 m＋60.8 ，相關(guān)系數(shù)r=0.9990.分別對維生素A和E的標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線的斜率進(jìn)行t檢驗，得p>0.05，即標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線的斜率無顯著性差異，所以本法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法來計算樣品中的維生素A和E的含量。

2.2.2 ?方法的檢出限 ?以儀器基線的3倍噪聲所對應(yīng)的待測物在進(jìn)樣液的濃度為方法的檢出限，以20μl血清，最終稀釋至50μl，取10μl進(jìn)樣，計算出樣品中維生素A和E的最低檢出濃度為0.035μg∕ml和0.09μg∕ml。完全可滿足實際樣品測定的要求。

2.2.3 ?方法的精密度取6份同一血清，各20μl，按樣品處理方法提取和測定，計算方法的精密度（表1）。由表1可見，本法維生素A和E測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.78%和5.43%。

表1 ??方法精密度實驗結(jié)果（n=6）

2.2.4 ?方法準(zhǔn)確度實驗 ???在3份相同樣品中，分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再按本法處理和測定，根據(jù)加標(biāo)前后測定值計算加標(biāo)回收率，實驗結(jié)果見表2。由表2可見，本法維生素A和E的加標(biāo)回收率分別為90.4%～103.2%（平均為94.9%）和81.0%～92.1%（平均為86.6%）。

表2 ??方法加標(biāo)回收率

2.2.5樣品測定用本法測定了15名健康成人的血清，所測維生素A的含量范圍為（0.56±0.05）μg/ml。維生素E的含量范圍為（8.46±0.57）μg/ml，與相關(guān)文獻(xiàn)的報道值一致。

3 ?結(jié)論本文建立了分散液相微萃取-高效液相色譜法分析維生素A和E的方法，該法操作簡便，大大縮短了分析時間，節(jié)約了試劑，是環(huán)境友好型的分析方法，在維生素A和E的快速檢驗中有著很好的推廣應(yīng)用價值。

參考文獻(xiàn)

［1］徐軍，張慧芬，邵裕坤，等.高效液相色譜法測定人血中脂溶性維生素的含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41（2）：147-149

［2］胡艷，王希希，孫成均.?高效液相色譜法同時測定微量全血中維生素A 和E［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36（1）：120-122

［3］Chatzimichalakis P F，Samanidou V?F，Papadoyannis I N. Journal of Chromatography B，2004，805（2）：289-296

［4］Sirimanne S?R, Patterson D G, Ma L, et?al. Journal of Chromatography B:?Biomedical ?Sciences and Applications，1998，716（1-2）：129-137

［5］李攻科，胡玉玲，阮貴華.樣品前處理儀器與裝置[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007

［6］Rezaee?M, Assadi Y, Milani Hosseini?M R, et al. Chromatography?A, 2006, 1116（1-2）: 1

［7］Li H, Lee H K. Journal of Chromatography A，2002，976(1～2)：377

［8］Berijani S, Assadi Y, Anbia M，et?al. Journal of Chromatography A, 2006, 1123(1)：1-9

［9］Nagaraju D，Huang S D. Journal of chromatography A，2007，1161(1～2)：89-97

［10］Zhou Q X, Bai H H, Xie G H,etc. Journal of Chromatography A, 2008, 1177(1)：43-49

［11］Jiang H M, Qin Y C, Hu B. Talanta，2008，74（5）：1160-1165

［12］Farajzadeh M A, Bahram M, Mehr B G, et?al. Talanta,2008,75（3）：832-840

［13］GB／T5009.82-2003.?食品中維生素A 和維生素E的測定